BIA(Biomolecular Interaction Analysis,生物分子相互作用分析)给予了实时观察生物分子间相互作用的技术。顺利获得它能观察两种分子结合的特异性,分析两种分子的结合强度,还能掌握生物分子结合过程中协同者和参与者的动态变化。
Biacore技术让研究者能够得到用其他传统方法难以取得的结果,因为它可以实时反映分子结合过程中每一秒的变化情况。无需借助标记物进行分析,使Biacore广泛应用于各类生物体系的测定——从各类小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸和寡聚糖,直至类脂、噬菌体、病毒和细胞。
BIA是英语"Biomolecular Interaction Analysis"的缩写,是给予实时观察生物分子间相互作用的技术平台,是分子相互作用研究的金标准之一。
1、传感器芯片(Sensor Chip):表面覆盖金属薄膜,用于固定生物分子配体(Ligand)
2、SPR光学检测系统:顺利获得检测共振角变化反映分子结合情况
3、微射流卡盘(Microfluidic Cartridge):精确控制样品流过芯片表面的流路系统
Biacore技术凭借其独特优势,已被广泛应用于科学生命和医药研发的众多领域,主要包括以下方面:
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Biacore实验的标准操作流程主要分为以下5个步骤,掌握规范的操作流程是取得可靠数据的关键:
样品准备
样品包括耦联于芯片表面的分子(ligand)和在溶液中流过芯片、与其发生相互作用的分析物(analyte)。如果 ligand 为小分子,需要检查其结构中是否含有可用于耦联反应的氨基等活性基团;如果没有,则需要考虑对分子进行适当修饰。
缓冲液准备
实验所用缓冲液均应经过过滤和脱气处理。如果缓冲液能够耐受高温,可采用高温灭菌处理。高温灭菌在一定程度上具有脱气作用,同时有利于延长缓冲液的保存时间。
耦联(Coupling)
具体操作可参照相应的耦联方法。
由于芯片表面通常带有负电荷,因此,在进行预结合实验时,需要顺利获得调整缓冲液的 pH,使待耦联分子带有适当的正电荷,从而促进其吸附于芯片表面,有利于后续共价耦联反应的进行。
预结合实验是将样品分别溶解于不同 pH 值的缓冲液中,使分子呈现不同程度的电荷状态。随后,将样品分别流过芯片表面,观察样品与芯片之间的结合响应,根据结合曲线确定适宜的耦联条件。
测试(Sample Analysis)
将分析物用适宜的缓冲液进行稀释后上样。应尽可能使样品缓冲液的组成与系统载流缓冲液保持一致,以减少缓冲液组成差异对检测结果的影响。
再生(Regeneration)
再生是指顺利获得适当的再生条件,将结合于芯片表面的分析物洗脱下来,同时尽可能保持芯片表面配体(ligand)的活性,以便芯片重复使用。
相较于传统研究分子相互作用的方法(如ELISA、共免疫沉淀、ITC等),Biacore SPR技术具有以下不可替代的优势:
Biacore是基于表面等离子共振(SPR)原理的生物大分子相互作用分析技术,无需使用荧光或同位素标记,即可实时监测生物分子间的结合、解离过程,并精确测定亲和力(KD)、动力学常数(ka、kd)等关键参数。
Biacore的核心优势包括:免标记分析(Label-free)、保持生物分子天然活性、超微量样品需求、快速分析、高灵敏度检测、可同步侦测两个流路,是分子相互作用研究领域的金标准方法。
Biacore广泛应用于蛋白质功能分析、分子交互作用特性表征、药物靶点鉴定、细胞信号传递研究、蛋白质结构与功能解析、癌症免疫机制研究、分子浓度测定、结合位点分析、疫苗研发、新药开发等领域。
Biacore系统由三个核心部分组成:① 传感器芯片(Sensor Chip)、② SPR光学检测系统、③ 微射流卡盘(Microfluidic Cartridge)。
Biacore标准操作包含5个步骤:① 样品准备(ligand与analyte);② 缓冲液过滤脱气;③ 耦联(将ligand固定到芯片表面);④ 测试(analyte上样);⑤ 再生(洗脱结合物)。
Biacore相比ELISA的优势在于:无需标记物、可实时监测结合解离动态、能取得动力学常数(不仅终点数据)、样品消耗更少、可测定微弱相互作用。
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